Nükleik asit ekstraksiyonunda kullanılmak üzere, gram-pozitif bakteriler ve mikobakterilerin hücre duvarlarının ortadan kaldırılmasında yeni bir yöntem: kum yöntemi

Abstract

Günümüzde moleküler yöntemler, enfeksiyon etkenlerinin hızlı tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla en sık olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi tercih edilmektedir. PCR kullanımında yeterli ve saf DNA veya RNA elde edilmesi önemlidir. Gram-negatif bakterilerde fenol-kloroform, DNAzol, proteinaz K, cam boncuk, kaynatma gibi farklı DNA ekstraksiyon yöntemleri başarıyla kullanılmaktadır. Hücre duvarında daha kalın peptidoglikan tabakası olan gram-pozitif bakteriler ile kompleks glikolipid bulunan mikobakteri cinsi bakterilerde ise, DNA ve RNA izolasyonu için bu kompleks yapıların ortadan kaldırılması gerekmektedir. Bu amaçla, stafi lokok cinsi gram-pozitif bakterilerde lizostafi n kullanılarak sferoplast oluşturulması, mikobakterilerde setil-trimetil amonyum bromür gibi kimyasallar kullanılarak bakteri duvarının tamamen veya kısmen uzaklaştırılması gerekmektedir. Herhangi bir kimyasal ajana gerek duyulmaksızın, bakteri hücre duvarının mekanik olarak ortadan kaldırılmasının amaçlandığı bu çalışmada, ince elenmiş kum partikülleri kullanılmış ve yöntem “kum yöntemi” olarak adlandırılmıştır. DNA ekstraksiyonu amacıyla ince elenmiş kum, küçük partiküllerini kaybetmeyecek şekilde ddH2O ile yıkanmış ve otoklavda sterilize edilmiştir. RNA ekstraksiyonu için ddH2O ile yıkanan kum, daha sonra %10 HCl’de (30 dakika) inkübe edilmiş ve otoklavda sterilize edilmiştir. Çalışmada, daha önce klinik bir örnekten izole edilen ve tanımlanan metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) suşu, 100 mg hazırlanan kum ve 100 μl Tris-EDTA çözeltisi içerisinde, 5 dakika maksimum hızda vortekslenmiş, DNA eldesi için proteinaz K ile muamele edilmiş ve sonrasında fenol kloroform-etanol presipitasyon protokolü takip edilmiştir. Kum yönteminin diğer yöntemler ile kıyaslanması amacıyla, kum yönteminde kullanılan miktardaki bakteri lizostafi n ile bir saat inkübe edildi ve kum yönteminde kullanılan miktarda proteinaz K eklenerek DNA ekstraksiyon işlemi tamamlanmıştır. Boncuk yönteminde steril cam boncuklar kum yönteminde olduğu şekilde kullanılmıştır. RNA eldesi için Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 25618, M.tuberculosis H37Ra ATCC 25177 ve M.tuberculosis H37Rv Pasteur Enstitüsü RSKK 598 standart suşları, 100 mg hazırlanan kum ve 20 μl Tris-EDTA çözeltisi içerisinde 3-5 dakika maksimum hızda vortekslenmiş ve guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform (GTFK) ile klasik RNA ekstraksiyon protokolü tamamlanmıştır. Elde edilen DNA’nın kullanılabilirliği, çalışmada kullanılan MRSA suşundaki stafi lokinaz ve enterotoksin genlerine özgül primerler kullanılarak PCR ile araştırılmıştır. Kum yöntemi ile elde edilen RNA’nın kullanılabilirliğini saptamak için, önce cDNA sentezi yapılmış; daha sonra M.tuberculosis atım pompa genlerinden Rv1410c, Rv2333c ve DrrA’ya özgül primerler kullanılarak PCR uygulanmıştır. Karşılaştırma amacıyla, kum yönteminde kullanılan miktardaki mikobakteriye doğrudan GTFK protokolü uygulanmıştır. MRSA suşlarından lizostafi n uygulanarak elde edilen DNA ile kum yöntemi uygulanarak elde edilen DNA’lar agaroz jelde yürütülmüş, spektrofotometrede miktar ve saflıkları kıyaslanmıştır. Sonuç olarak, yaklaşık aynı miktar ve saflıkta DNA’ların elde edildiği gözlenmiştir. Kum yöntemiyle elde edilen DNA’ların herhangi bir inhibitör ajan içermediği, PCR’nin etkin olarak çalışmasıyla gösterilmiştir. Mikobakteri suşlarından kum yöntemiyle RNA elde edilebildiği halde, diğer yöntemlerle RNA elde edilememiştir. Kum yöntemi kullanılarak elde edilen RNA’ların gerek cDNA sentezinde gerekse bu cDNA’ların kullanıldığı PCR yönteminde etkin olarak çalıştığı gösterilmiştir. Çalışmamızda tanımlanan kum yöntemi ile nükleotid eldesi zor olan sert ve kompleks hücre duvarına sahip bakterilerden, saf ve yeterli miktarda DNA ve RNA elde edildiği belirlenmiştir. Sonuç olarak bu yöntemin, pahalı sayılabilen lizostafi n veya farklı kimyasalların yerine herhangi bir masrafı olmayan kumun kullanılması sayesinde ekstraksiyon maliyetini düşüreceği, ayrıca DNA ekstraksiyon süresini kısaltması açısından avantajlı olacağı düşünülmüştür

Nowadays molecular methods are widely used in the rapid diagnosis of infectious agents. Polymerase chain reaction (PCR) is the most preferred method for this purpose. Obtaining suffi cient and pure DNA or RNA is important for the PCR. Different DNA extraction protocols such as phenol-chloroform, proteinase K, glass beads and boiling have been used successfully for DNA isolation from gramnegative bacteria. However since gram-positive bacteria have a thicker layer of peptidoglycan and mycobacteria have complex glycolipids in their cell walls, for the isolation of DNA or RNA from these microorganisms, the complex cell wall structure must be eliminated. For this purpose, the bacterial cell wall must be completely or partially removed forming sferoblast using lysostaphin in the Staphylococcus genus as gram-positive bacteria and using a chemical like cetyltrimethyl ammonium bromide for the Mycobacterium genus. In this study, we planned to use sand particles for the mechanical elimination of the cell wall without any need for chemicals and we called this procedure as “sand method”. For the purpose of DNA extraction, the fi ne-grained sand was washed with ddH2O without losing small particles and then sterilized by autoclaving. For the purpose of RNA extraction; the sand was washed with ddH2O, incubated for 30 minutes with 10% HCl, and then autoclaved. A methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strain previously isolated and identifi ed from a clinical specimen was mixed in 100 μl TrisEDTA buffer with 100 mg sand. The mixture of bacteria and sand was vortexed at the maximum speed for 5 minutes. The MRSA-sand mix was treated with proteinase K and phenol-chloroform, and ethanol precipitation protocol was then followed for obtaining DNA. For comparison of the sand method with the other methods, the same amount of bacteria used in the sand method was incubated for one hour with lysostaphin, and then the proteinase K DNA extraction method were completed in the same way used in the sand method. For obtaining RNA from M.tuberculosis H37Rv ATCC 25618, M.tuberculosis H37Ra ATCC 25177 and M.tuberculosis H37Rv Pasteur Institute RSKK 598 standard strains, bacteria were dissolved in 20 μl Tris-EDTA buffer with 100 mg sand. The mixture of bacteria and sand was vortexed at the maximum speed for 5 minutes. After that, the classic RNA extraction protocol using guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (GTPC) was completed. To investigate the usefulness of the obtained DNA, a PCR was performed with specifi c primers for staphylokinase and enterotoxin genes that were shown in the genome of the chosen MRSA strains from our previous studies. To investigate the usefulness of the obtained RNA from the sand method; fi rst cDNA synthesis is completed. The PCR effi ciency was then tested using primers specifi c to the effl ux pump genes of M.tuberculosis including Rv1410c, Rv2333c, and DrrA genes. To compare the effect of the sand method, GTPC protocol was applied in the same amount of mycobacteria without the sand treatment. The DNA obtained from MRSA with the application of lysostaphin and the DNA obtained from MRSA by the sand method were run in agarose gel electrophoresis. The amount and purity of DNAs were measured with a spectrophotometer. The same amount and purity of the DNAs were approximately the same in both of the extraction methods. The existence of non-inhibitors of DNA in the sand method was shown with the PCR, which have worked effi ciently with the DNAs obtained from the sand method. RNA was obtained effi ciently from the Mycobacterium strains by the sand method, but no RNA could be obtained from the mycobacteria with the other methods. It was shown that the RNA obtained using the sand method worked effectively in both cDNA synthesis and PCR in which synthesized cDNA was used. The sand method described in the study worked effectively to obtain suffi cient amount of pure DNA and RNA from the bacteria containing rigid cell walls that are diffi cult to obtain the nucleotide. It was concluded that, using the sand method instead of relatively expensive lysostaphin or other chemicals, has important advantages such as decreasing the cost and the shortening of the DNA extraction period.